台湾专利TW201323437A 豬第二型環狀病毒次單位疫苗

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专利摘要:
本發明係關於一種抗豬第二型環狀病毒(PCV2)免疫組合物，包含一抗原胜肽，該抗原胜肽係為PCV2第二開放閱讀區(open reading frame 2,ORF2)非富含精胺酸胜肽(non-Arginine-rich peptide)及/或將該PCV2 ORF2非富含精胺酸胜肽進一步與一PE胜肽及一KDEL胜肽構築形成之一重組融合蛋白。該PCV2 ORF2非富含精胺酸胜肽之精胺酸數量係為PCV2 ORF2全長胜肽之N端富含精胺酸區域(Arginine-rich domian)之精胺酸數量的二分之一以下。
公开号:TW201323437A
申请号:TW101144533
申请日:2012-11-28
公开日:2013-06-16
发明作者:Tsun-Yung Kuo；Hsu Chung Gabriel Chen；Shu-Hsiang Yang；Yu-San Chen
申请人:Sbc Virbac Biotech Co Ltd；
IPC主号:C07K14-00

专利说明:
豬第二型環狀病毒次單位疫苗
本發明係關於一種豬第二型環狀病毒(Porcine circovirus type 2,PCV2)次單位疫苗，特別是指一種可以被大量表現之PCV2 ORF2蛋白質片段做為抗原蛋白質，以及加入適當之載劑或佐劑而形成之豬第二型環狀病毒次單位疫苗。
豬第二型環狀病毒已知與離乳後多系統消耗性綜合症(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)、豬皮膚炎腎病症候群(Porcine Dermatitis And Nephropathy Syndrome,PDNS)有關。PMWS最早於1991在加拿大發現，且之後於全世界各地陸續有被報導。該病對於全球養豬業造成嚴重損失，其主要病徵為患豬體重漸進性喪失(progressive weight loss)、急性呼吸症(tachypnea)、呼吸困難(dyspnea)、黃疸(jaundice)等。病理學上，肉眼及組織病變有淋巴球性肉芽腫性浸潤(lymphocytic and granulomatous infiltrate)、淋巴結病(lymphadenopathy)、淋巴球性肉芽腫性肝炎(lymphocytic and granulomatous hepatitis)及腎炎(nephritis)。
豬環狀病毒(porcine circovirus,PCV)最早於1982年在豬腎細胞株(PK-15,ATCC CCL31)中被發現，雖然會持續感染該細胞，但是並不產生細胞病變效應(cytopathic effect,CPE)，另外該病毒雖會感染豬隻，但是並不造成任何病變，該病毒株係命名為PCV1。PCV1病毒為一環狀單股、全長1759 bp的正二十面體(icosahedron)病毒，在1995年被歸類為環狀病毒科(Circoviridae)的一員。
自PK-15細胞中分離出之PCV1被認定是不具備病源性，而於1997年自罹患離乳後多系統消耗性綜合症(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)豬隻體內，分離出對豬隻具有病原性之突變豬環狀病毒，該病毒株命名為PCV2。離乳後多系統消耗性綜合症(PMWS)是一種具有高度傳染力的豬隻疾病，該病主要感染幼豬及懷孕母豬，嚴重影響豬隻健康。
PCV2病毒直徑大小為17 nm，具有環狀單股DNA，DNA大小為1.76 Kb，基因組序列經軟體分析後發現順時針加上逆時針共有11個開放閱讀區(open reading frame,ORF)，其中ORF1、ORF2是2個最主要的基因。ORF1可轉錄出Rep及Rep’蛋白，和該病毒的複製有關(Mankertz et al.,2001)。已知ORF2本身是PCV2病毒之免疫性結構殼體蛋白(immunogenic structure capsid protein)，用以誘導生物體產生免疫反應。
最常見的市售PCV2疫苗為PCV2死毒疫苗，然而死毒疫苗研發上需取得無其他病毒感染之細胞株，且其最大的缺點在於無法確保在製備死毒疫苗過程中，化學藥劑是否完全不活化病毒株；而另一缺點在於以化學藥劑來殺死病原菌很有可能會改變病原菌的抗原結構，使得所誘發出來的免疫反應無法中和病原菌的毒性，因此造成該死毒疫苗無法保護豬隻避免感染此疾病；由此可知，死毒疫苗產品發展不易、成本高，且其安全性堪慮。
相對於死毒疫苗是以整株病毒作為疫苗之抗原，次單位疫苗則是取病原菌中一部分的蛋白質作為抗原蛋白質，並將該抗原蛋白質作為疫苗接種到動物或人體中，使接種後的動物或人體可產生免疫力。它的製備方式是先選殖病原菌中的抗原蛋白質的基因，然後以遺傳工程的技術將此抗原蛋白質大量生產。其最大的優點是安全性高，因為它只是病原菌的一個部分，所以注射到豬隻體內的並不是一個完整的病原菌，不會有病原菌不活化不完全的顧慮。習用PCV2次單位疫苗係使用ORF2蛋白片段作為抗原蛋白質；然而ORF2之全長蛋白質在原核生物表現系統中表現量很低，不符製備疫苗之需求。因此，研發可以在生物表現系統中表現量高的PCV2 ORF2疫苗抗原片段，將有助於PCV2次單位疫苗之商業應用。
本發明提供一種PCV2病毒ORF2蛋白片段的DNA序列，該DNA序列可於生物表現系統中表現出大量的PCV2病毒ORF2蛋白片段。
本發明並提供一種PCV2次單位疫苗，係以可在生物表現系統中大量表現之PCV2病毒ORF2蛋白片段作為疫苗之抗原蛋白，使該疫苗在施打於動物體後，可以誘導動物體產生足以抵抗PCV2病毒感染之免疫力。
本發明並提供一種利用基因重組技術所研發之次單位疫苗，以生產製程簡單、成本低、純度高、安全性佳之PCV2次單位疫苗。
由於PCV2病毒ORF2蛋白全長片段難以在生物系統中大量表現，為達成上述發明目的，本案發明人利用基因重組技術，將PCV2病毒中編碼ORF2全長蛋白(如SEQ ID NO：2所示)之DNA序列(如SEQ ID NO：1所示)，進行不同長度的切割，再將所形成的各DNA片段分別構築至蛋白表達載體上，於生物系統中表現蛋白質，以決定於生物系統中可產生高量蛋白質之DNA片段。
經蛋白質序列分析以及蛋白表現量試驗結果顯示，PCV2病毒ORF2全長蛋白共有約30個精胺酸(Arginine)，其中三分之二以上的精胺酸集中於ORF2蛋白之胺基端(amino terminal，N端)，當ORF2蛋白N端的精胺酸數目被去除的越多，ORF2蛋白片段在生物表現系統中的表現量就越多；而去除編碼ORF2蛋白之DNA序列5’端234 bp後所剩之DNA片段(即5’端235 bp至終止密碼子(stop codon)之間的片段)，可以在生物表現系統中大量表現。
是以，本發明所提供之PCV2次單位疫苗，包括一PCV2抗原蛋白質片段，以及適當之載劑或佐劑；該抗原蛋白質片段可於生物表現系統中大量表現，係為PCV2病毒之ORF2非富含精胺酸胜肽(non-Arginine-rich peptide)，該PCV2 ORF2非富含精胺酸胜肽之精胺酸數量係為該PCV2 ORF2全長胜肽之N端富含精胺酸區域(Arginine-rich domian)之精胺酸數量的二分之一(1/2)以下；於一實施例中，當該PCV2 ORF2之N端富含精胺酸區域之精胺酸數量為20時，則於該PCV2 ORF2非富含精胺酸胜肽之精胺酸數量等於0或1至10之間的正整數；於另一實施例中，當該PCV2 ORF2之N端富含精胺酸區域之精胺酸數量為21時，則於該PCV2 ORF2非富含精胺酸胜肽之精胺酸數量等於0或1至10之間的正整數；於又一實施例中，當該PCV2 ORF2之N端富含精胺酸區域之精胺酸數量為22時，則於該PCV2 ORF2非富含精胺酸胜肽之精胺酸數量等於0或1至11之間的正整數。
於一實施例中，該富含精胺酸區域為該PCV2 ORF2全長胜肽之胺基端(N端)第1-78個胺基酸之區域(相當於DNA序列之5端第1-234個核苷酸之間的區域)；於一實施例中，該非富含精胺酸胜肽為該PCV2 ORF2全長胜肽之胺基端(N端)第79個胺基酸至羧基端(C端)最後一個胺基酸間之胜肽(相當於DNA序列之5’端第235個核苷酸至3’端終止密碼子之間的區域)。
該PCV2 ORF2全長胜肽與如SEQ ID No：2、SEQ ID No：16、SEQ ID No：20、SEQ ID No：51及SEQ ID No：53所示之序列其中之一具有至少80%序列同源性(homology)，較佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。於一較佳實施例中，該PCV2 ORF2全長胜肽係為如SEQ ID No：2、SEQ ID No：16、SEQ ID No：20、SEQ ID No：51及SEQ ID No：53所示之序列其中之一。
此外，本發明並利用綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(exotoxin A)的受體結合區(receptor binding domain I)及運輸結構區(transmembrane targeting domain II)之蛋白(即PE蛋白)以及內質網回收訊號(ER retention signal，即KDEL蛋白質訊號序列(signal peptide))的特性，提供一種PCV2 ORF2融合蛋白抗原片段。
綠膿桿菌PE蛋白係可作為目標蛋白的引導媒介，其作用的方式為：首先，綠膿桿菌外毒素A的受體結合區蛋白負責與目標細胞(CD8+ T細胞)的細胞膜上的細胞受體(receptor)結合，經由細胞內噬作用(endocytosis)進入細胞的內膜體(endosome)中，當綠膿桿菌外毒素A被內膜體中的蛋白酶切割後，綠膿桿菌外毒素A的運輸結構區蛋白會將剩餘的蛋白片段(含運輸結構區蛋白及其後所連接之目標蛋白)由內膜體位移至細胞質內，與高基氏體(Golgi body)及內質網(endoplasmic reticulum,ER)結合，進而將目標蛋白引導至目標細胞中。
另外，若一目標蛋白之C端具有一KDEL蛋白質訊號序列(signal peptide)，則在該KDEL蛋白質訊號序列的作用下，目標蛋白會被回收至內質網，進而進入內質網進行作用。
因此，本發明進一步利用PE蛋白及KDEL蛋白質訊號序列的特性，提供一種PCV2 ORF2融合蛋白抗原片段，係於PCV2病毒ORF2蛋白片段之N端加上PE蛋白，且於該PCV2病毒ORF2蛋白片段之C端加上KDEL蛋白質訊號序列(signal peptide)，以產生抗原融合蛋白(PE-ORF2片段-KDEL)，使該疫苗在施打於動物體後，可以誘導動物體產生足以抵抗PCV2病毒感染之免疫力。
於部分實施態樣中，本發明所用之抗原蛋白包含但不限於PCV2病毒ORF2蛋白片段，該ORF2蛋白片段係與如SEQ ID No：6、SEQ ID No：8、SEQ ID No：10、SEQ ID No：12、SEQ ID No：18、SEQ ID No：22、SEQ ID No：55及SEQ ID No：57所示之序列其中之一具有至少80%序列同源性，較佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。於一較佳實施例中，該PCV2病毒ORF2蛋白片段係為如SEQ ID No：6、SEQ ID No：8、SEQ ID No：10、SEQ ID No：12、SEQ ID No：18、SEQ ID No：22、SEQ ID No：55及SEQ ID No：57所示之序列其中之一，該蛋白片段係藉由基因轉殖方式而得；分別將編碼PCV2病毒ORF2蛋白片段之DNA序列(如：SEQ ID NO：5,7,9,11,17,21,54,56)選殖到表現載體中，各形成含有編碼抗原蛋白之DNA序列的質體，再將該質體轉殖到生物表現宿主中，經蛋白質表現後而得到之抗原蛋白。
本發明所用之抗原融合蛋白(PE-ORF2片段-KDEL)係藉由基因轉殖方式而得，係將上述編碼PCV2 ORF2之DNA部分片段序列(如：SEQ ID NO：5,7,9,11,17,21,54,56)、編碼PE蛋白質訊號序列之DNA片段序列(如SEQ No：34所示)，以及編碼KDEL蛋白質訊號序列之DNA片段序列(如SEQ No：30所示)選殖到表現載體系統中，形成含有編碼抗原融合蛋白之DNA序列的質體，再將該質體轉殖到表現宿主中，經蛋白質表現後而得到之抗原融合蛋白。
該表現載體系統包含但不限於pET載體系統以及pGEX載體系統等；於一實施例中，該表現載體為pET24a；該生物表現系統(宿主)包含但不限於：原核表現系統(如：大腸桿菌(Escherichia coli))、真核表現系統(如：動物細胞(CHO cell)、植物細胞)，於一實施例中，該表現系統為大腸桿菌(E.coli)。
該佐劑包含但不限於水性氫氧化鋁膠、明礬、Freund氏不完全佐劑、油質佐劑、水溶性佐劑、或水包油包水雙相佐劑(water-in-oil-in-water,W/O/W)；於一實施例中，該佐劑為油質佐劑。
本發明所提供之免疫組合物，進一步可包含PCV2其他開放閱讀區(open reading frame,ORF)之抗原蛋白，該PCV2其他ORF之抗原蛋白包含但不限於：ORF1、ORF3。此外，該免疫組合物可進一步包含一種病原抗原，該病原抗原係選自由下列群組所組成者：豬流感病毒(SIV)抗原、豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)抗原、豬黴漿菌(Mycoplasma)、豬小病毒(Parvovirus,PPV)、豬丹毒(Erysipelas)，以及偽狂犬病(Aujeszky's disease)。
另，本發明所提供之免疫組合物可進一步包含一或多種選自於下者：載劑、溶劑、乳化劑、懸浮劑、分解劑、黏結劑、賦形劑、安定劑、螯合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤滑劑、界面活性劑、佐劑、生物型載體。
本說明書中所述之所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。
本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。實施例一 PCV2次單位疫苗抗原蛋白片段之構築及決定
由於PCV2病毒ORF2蛋白全長片段難以在生物表現系統中大量生產，因此本案發明人將PCV2 ORF2蛋白之基因分成不同DNA片段，並將這些不同的DNA片段構築至載體上，於生物表現系統中表現各DNA片段編碼之蛋白質，並分析各DNA片段在生物表現系統中的蛋白質產量，以決定於生物表現系統中可產生高量蛋白質之較佳DNA片段。
以下，係以常用之原核生物表現系統(大腸桿菌)用以分析及說明。
1.增幅不同長度PCV2 ORF2基因片段
本實施例中所使用的PCV2 ORF2基因序列全長如SEQ ID No：1所示，根據Wang等人(Wang et al.,Virus Research 2009,Genetic variation analysis of Chinese strains of porcine circovirus type 2)所提供之序列作為親源關係樹標準序列來分析SEQ ID No：1；結果顯示該PCV2 ORF2序列(SEQ ID No：1)屬於PCV2 2a亞群(subgroup)的一員(如圖一所示)。針對上述PCV2 2a之ORF2(以下稱為2a-ORF2)基因序列設計可增幅不同長度2a-ORF2基因片段之引子(如表一所示)，以進行聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)增幅各片段。
如圖二所示，全長之2a-ORF2基因片段以專一性引子pF1(正向引子)及pR1(反向引子)進行PCR增幅，取得全長2a-ORF2基因片段之DNA序列如SEQ ID NO：1所示，以下簡稱2a-ORF2；而不同長度之PCV2 2a-ORF2基因片段則分別命名為2a-F1、2a-F2、2a-F3、2a-F4、2a-F5及2a-F6。2a-F1片段位於PCV2 2a-ORF2之5’端第1至234個核苷酸之位置，2a-F1片段之DNA序列如SEQ ID NO：3所示。2a-F2片段位於PCV2 ORF2之5’端第235至468個核苷酸之位置，2a-F2片段之DNA序列如SEQ ID NO：5所示。2a-F3片段位於PCV2 ORF2之5’端第469至699個核苷酸之位置，2a-F3片段之DNA序列如SEQ ID NO：7所示。2a-F4片段位於PCV2 ORF2之5’端第349至699個核苷酸之位置，2a-F4片段之DNA序列如SEQ ID NO：9所示。2a-F5片段位於PCV2 ORF2之5’端第235至699個核苷酸之位置，2a-F5片段之DNA序列如SEQ ID NO：11所示。2a-F6片段位於PCV2 ORF2之5’端第1至468個核苷酸之位置，2a-F6片段之DNA序列如SEQ ID NO：13所示。所有的正向引子(forward primer)均設計具Hind III的限制酶切位，而反向引子(reverse primer)均設計具Xho I的限制酶切位。

PCR反應條件為：95℃反應5分鐘後，進行95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒，共25個循環，最後以72℃反應5分鐘以進行延伸反應(elongation)；所得之PCR產物大小分別為：2a-ORF2為699 bp、2a-F1為234 bp、2a-F2為234 bp、2a-F3為231 bp、2a-F4為351 bp、2a-F5為465 bp、2a-F6為468 bp。並以2%洋菜膠電泳(agarose electrophoresis)鑑定各PCR產物片段大小。鑑定無誤後，以PCR-M純化套組(Viogene)純化各PCR產物。
2.將不同長度PCV2 ORF2基因片段構築於pET24a表現載體
分別將1 μg PCR產物與1 μg的pET24a表現載體(Novagen)，以1 μl Hind III及1 μl Xho I(New England Biolabs)兩種限制酶進行限制酶切割反應(Restriction Enzyme Cleavage Reaction)，於37℃反應8小時。再以PCR-M Clean up System純化套組(Viogene)純化酶切後之PCR產物及pET24a表現載體，接著進行接合反應(ligation)。將各PCR產物選殖到pET24a載體以取得pET24a-2a-F1、pET24a-2a-F2、pET24a-2a-F3、pET24a-2a-F4、pET24a-2a-F5、pET24a-2a-F6及pET24a-2a-ORF2質體，並將上述質體分別利用轉殖作用(transformation)送入表現宿主大腸桿菌(E.coli)中，經選殖挑選出菌株中帶有PCR片段之質體後，進行定序確認增殖之PCR產物序列無誤，以得到含有上述質體之菌株。
3.不同長度PCV2 ORF2基因片段之蛋白表達及確認
先將含有上述質體之菌株以2 ml之LB培養基，於37℃培養16-18小時，再將菌液以1：50的比例接種至LB培養基中，培養基中含有25 μg/ml kanamycin，置於37℃、200 rpm之培養箱中培養，直到菌液濃度達O.D 600 nm為0.6時，加入β-D-thiogalactoside(IPTG)使其最終濃度為1 mM，再於37℃、200 rpm之培養箱中培養6小時，吸取1 ml菌液，經10,000×g離心後，取離心後之菌塊以B-PERTM細菌蛋白質萃取試劑(B-PERTM Bacterial Protein Extraction，購自PIERCE)來確認重組蛋白為可溶性蛋白或是包涵體(inclusion body)。確認方法為於菌塊中加入40 μl的反應試劑，劇烈震盪(vortex)1分鐘後，10,000×g離心，離心後重組蛋白在上層部份為可溶性蛋白，在下層部份則為包涵體。將可溶性蛋白溶於SDS-PAGE用的1x sample buffer，下層的菌塊則加入2x的SDS-PAGE sample buffer。以乾浴槽100℃煮沸20分鐘後離心之，吸取上層液體部份，以15%的SDS-PAGE確認重組蛋白表現的情況。
以IPTG誘導含有上述質體之菌株產生重組蛋白，其中2a-ORF2重組蛋白之胺基酸序列如SEQ ID No：2所示；2a-F1重組蛋白之胺基酸序列如SEQ ID No：4所示，2a-F2重組蛋白之胺基酸序列如SEQ ID No：6所示，2a-F3重組蛋白之胺基酸序列如SEQ ID No：8所示，2a-F4重組蛋白之胺基酸序列如SEQ ID No：10所示，2a-F5重組蛋白之胺基酸序列如SEQ ID No：12所示，2a-F6重組蛋白之胺基酸序列如SEQ ID No：14所示。
以SDS-PAGE確認各片段重組蛋白表現之結果如圖三所示，第1道為標準分子量梯度(Molecular weight ladder)，第2道為負對照組(pET24a)，第3道為2a-F1重組蛋白(12.7 kDa)，第4道為2a-F2重組蛋白(11.6 kDa)，第5道為2a-F3重組蛋白(12.1 kDa)，第6道為2a-F4重組蛋白(16.5 kDa)，第7道為2a-F5重組蛋白(21.4 kDa)，第8道為2a-F6重組蛋白(20.8 kDa)，第9道為2a-ORF2全長重組蛋白(27.5 kDa)。於2a-ORF2的6個片段中，2a-F2、2a-F3、2a-F4、2a-F5片段都能大量表現(圖三第4、5、6、7道)，其分子量位置與預測的11.6kDa、12.1kDa、16.5kDa、21.4kDa符合。
接著以西方墨漬分析法(Western Blot)確認表達重組蛋白是否為PCV2 2a-ORF2之片段。將SDS-PAGE電泳分析後之膠體轉印到PVDF尼龍膜(Nylon membrane)上。轉印後將尼龍膜置於填塞液(Blocking buffer：5% Skim milk,in TBST)於室溫作用1小時，以去除非特異性反應。之後，加入第一級抗體：老鼠抗6x組織胺酸之單株抗體[標幟鹼性磷酸酶(AP)]於室溫作用1小時，再以TBST液(10 mM Tris-HCl pH 8.0,150 mM NaCl,0.1% Tween 20)清洗6次，每次各5分鐘。洗滌後，加受質(NBT/BCIP,Bio-Rad)呈色約10分鐘後，以清水水洗終止呈色反應。
西方墨漬分析法結果如圖四所示，第1道為標準分子量梯度(Molecular weight ladder)，第2道為負對照組(pET24a)，第3道為2a-F1重組蛋白(12.7 kDa)，第4道為2a-F2重組蛋白(11.6 kDa)，第5道為2a-F3重組蛋白(12.1 kDa)，第6道為2a-F4重組蛋白(16.5 kDa)，第7道為2a-F5重組蛋白(21.4 kDa)，第8道為2a-F6重組蛋白(20.8 kDa)，第9道為2a-ORF2全長重組蛋白(27.5 kDa)。西方墨漬分析法結果與SDS-PAGE分析結果(如圖三所示)相同。2a-ORF2全長重組蛋白(圖四第9道)無法表現；2a-ORF2的6個片段中，2a-F2、2a-F3、2a-F4、2a-F5片段的蛋白都能被大量表現(圖四第4、5、6、7道)，其分子量位置與預測的11.6kDa、12.1kDa、16.5kDa、21.4kDa符合。然而，2a-F1和2a-F6片段並沒有重組蛋白的表現(圖四第3、8道)，由於2a-F1和2a-F6片段都涵蓋了從PCV2 2a-ORF2之5’端第1至234個核苷酸的基因片段(請參閱圖二所示)，因此，造成ORF2基因無法大量表現的原因可能是該2a-F1片段內的某些序列，故針對2a-F1片段(PCV2 2a-ORF2之5’端第1至234個核苷酸，SEQ ID No：3)及2a-F2+2a-F3片段(PCV2 2a-ORF2之5’端第235至699個核苷酸(不含終止密碼子)，SEQ ID No：11)的胺基酸序列分析後，發現2a-F1片段胺基酸序列(SEQ ID No：4)之精胺酸(Arginine)含量是2a-F2+2a-F3片段胺基酸序列(SEQ ID No：12)的2倍以上(如表二所示)；本案發明人進一步將該些精胺酸增加或刪除後，去分析蛋白質表現，發現將該些過多之精胺酸減少後，確實可增加PCV2 ORF2之蛋白表現量。
實施例二 PCV2次單位疫苗抗原蛋白片段之免疫原性(immunogenicity)的決定
1.大鼠免疫試驗
將實施例一所得到之2a-F2、2a-F3、2a-F4、2a-F5重組蛋白以弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)製備為各種PCV2次單位疫苗，並進行大鼠(rats)免疫試驗，以分析各重組蛋白之引發試驗動物產生抗PCV2抗體之免疫原性。
取5~6週齡健康雌性清潔級大鼠15隻作為試驗動物，所有大鼠的豬第二型環狀病毒(PCV2)酵素結合免疫吸附分析(ELISA)抗體皆呈陰性。將這15隻大鼠隨機分為5組，每組3隻；第1~4組中，每隻大鼠分別以皮下注射(subcutaneously,S.C.)注射200 μg重組蛋白，注射疫苗總體積為300 μL，其中重組蛋白與佐劑之體積比為1：1。第5組則注射300 μL PBS作為負對照組。兩週後用相同免疫劑量加強免疫一次；各組隔離飼養觀察，首次免疫後第0、2、4、8週分別採血分離血清，以酵素連結免疫分析(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測定血清內抗豬第二型環狀病毒(PCV2)之抗體力價。
2.血清抗體之判定-以ELISA測定抗PCV2抗體力價
以含有PCV2病毒抗原(300 ng/孔)之96孔抗原盤作為檢測套組。以含有500 μl/L Tween-20的50 mmol/L PBS(pH 7.2)(即PBST)洗滌抗原盤3次，每次3~5分鐘；再於抗原盤中加入0.15% BSA填充液(blocking solution)(200μL/孔)，以填充(block)抗原盤，並於37℃下作用2小時後，以PBS洗滌。將待檢測之大鼠血清以PBS緩衝液以1：50倍數稀釋，然後再做倍比稀釋；每個樣品8重複，每孔加100μL稀釋之大鼠血清，於37℃下作用1小時後，以PBS洗滌；然後加入鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)標定之anti-mouse IgG抗體，於37℃下作用1小時後，以PBS洗滌；接著加入磷酸對硝基苯酯(para-Nitrophenylphosphate,pNPP)溶液顯色，最後用1M的NaOH終止反應後判定結果。讀取各樣本在405 nm波長下之吸光值，每個樣本讀取兩次，並取平均值進行分析。
ELISA分析結果如圖五所示。在實施例一所得到之2a-F2、2a-F3、2a-F4、2a-F5重組蛋白皆可誘發試驗動物產生抗PCV2之血清抗體；其中又以2a-F2重組蛋白片段(SEQ ID No：6)可以引發試驗動物產生最高量之抗PCV2血清抗體，且相較於注射PBS之負對照組，抗體產生量皆具有顯著差異(p<0.05)。
本案發明人進一步亦將該2a-F2、2a-F3、2a-F4、2a-F5重組蛋白進行豬隻免疫，結果發現該等重組蛋白皆可誘發豬隻產生抗PCV2血清抗體。此外，亦藉由PCV2攻毒試驗評估該等重組蛋白之免疫保護效力：將該等重組蛋白配製成次單位疫苗後，進行豬隻免疫後，再以PCV2病毒株攻毒，結果發現經攻毒後，免疫組之保護率高於對照組(未施以疫苗者)；此處所指之保護率提高包含：病毒血症之降低、PCV2病徵之減緩。因此，證實該等重組蛋白所製備之PCV2次單位疫苗可有效提供動物產生免疫力，以提高動物之存活率。實施例三 PCV2 2a次單位疫苗抗原蛋白片段之構築及表達
由實施例二之試驗結果可知，PCV2 ORF2的F2蛋白片段可引發試驗動物產生最高量之抗PCV2血清抗體；為了提高PCV2次單位疫苗之免疫原性，在本實施例中，將實施例一所得之2a-F2蛋白片段之N端加上綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(exotoxin A)的受體結合區(receptor binding domain I)及運輸結構區(transmembrane targeting domain II)之蛋白(即PE蛋白)，且於該2a-F2蛋白片段之C端加上內質網回收訊號(ER retention signal)-KDEL蛋白質訊號序列(signal peptide)，以產生抗原融合蛋白(PE-2a-F2-KDEL)，以期誘導生物體產生更佳之免疫反應。
該抗原融合蛋白(PE-2a-F2-KDEL)係透過基因轉殖技術，將編碼各蛋白之DNA序列轉入表現載體中，形成一抗原融合蛋白表現載體(pET24a-PE-2a-F2-KDEL)，並誘導該抗原融合蛋白表現載體表現該抗原融合蛋白(PE-2a-F2-KDEL)。首先，取編碼KDEL蛋白質訊號序列之DNA序列(SEQ ID No：30)，轉殖到pET24a質體中，以形成pET24a-KDEL質體；然後，取實施例一所得之2a-F2片段DNA序列(SEQ ID No：5)，轉殖到該pET24a-KDEL質體中，以形成pET24a-2a-F2-KDEL質體；最後，取編碼PE蛋白之DNA序列(SEQ ID No：34)，轉殖到該pET24a-2a-F2-KDEL質體中，以形成pET24a-PE-2a-F2-KDEL質體。
1. pET24a-KDEL質體的構築
編碼KDEL蛋白質訊號序列(SEQ ID No：31)之DNA序列如SEQ ID No：30所示，以PCR進行擴增，KDEL專一性引子(KDEL specificity primers)之序列如下所示：正向引子(含有Hind III限制酶酶切位置)：5’-CCC AAGCTT CTCAAAAAAGACGAACTGAGAGATGAACTGAAAGA-3’(SEQ ID No：32)Hind III反向引子(含有Xho I限制酶酶切位置)：5’-GTG CTCGAG CAGTTCGTCTTTCAGTTCATCT-3’(SEQ ID No：33)Xho I PCR反應條件為：94℃反應3分鐘後，進行95℃ 1分鐘、55℃ 1分鐘、72℃ 20秒，共5個循環，最後以72℃反應1分鐘以進行延伸反應(elongation)；分別將PCR產物與pET24a載體進行雙酶切(以Hind III及Xho I兩種限制酶進行酶切反應)，再將酶切後的PCR產物與pET24a載體進行純化以及接合(ligation)作用，以將PCR產物選殖到pET24a載體形成pET24a-KDEL質體，並將pET24a-KDEL質體利用轉殖作用(transformation)送入寄主細胞大腸桿菌(E.coli)中，以進行大量增殖，並進行定序確認增殖之PCR產物序列無誤。
2. pET24a-2a-F2-KDEL質體的構築
以PCR增殖實施例一所得之2a-F2 DNA片段(SEQ ID No：5)，PCR引子序列如下：正向引子pF2-1(含有Sac I限制酶酶切位置)：5’-CGAGCTCTTTGTTCCCCCGGGAGGGGGG-3’(SEQ ID No：38)Sac I反向引子pR2-1(含有Hind III限制酶酶切位置)：5’-CCCAAGCTTGTAGGAGAAGGGTTGGGGGATT-3’(SEQ ID No：39)Hind III PCR反應條件為：95℃反應5分鐘後，進行95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒，共25個循環，最後以72℃反應5分鐘以進行延伸反應(elongation)；分別將PCR產物與上述pET24a-KDEL質體進行雙酶切(以Sac I及Hind III兩種限制酶進行酶切反應)，再將酶切後的PCR產物與pET24a-KDEL質體進行純化以及接合作用，以將PCR產物選殖到pET24a-KDEL質體形成pET24a-2a-F2-KDEL質體，並將該質體利用轉殖作用(transformation)送入寄主細胞大腸桿菌(E.coli)中，以進行大量增殖，並進行定序確認增殖之PCR產物序列無誤。
3. pET24a-PE-2a-F2-KDEL質體的構築
編碼PE蛋白(SEQ ID No：35)之DNA序列如SEQ ID No：34所示，以PCR進行擴增，PE專一性引子(PE specificity primers)之序列如下所示：正向引子(含有BamH I限制酶酶切位置)：5’-CGGGATCCGAAGAAGCGTTCGAC-3’(SEQ ID No：36)BamH I反向引子(含有EcoRI及Sac I限制酶酶切位置)：5’-CGGAATTCGAGCTCGCAGGTCAGGCTCACCAC-3’(SEQ ID No：37)EcoR I Sac I PCR反應條件為：94℃反應5分鐘後，進行95℃ 1分鐘、55℃ 1分鐘、72℃ 1.5分鐘，共30個循環，最後以72℃反應7分鐘以進行延伸反應；分別將PCR產物與上述pET24a-2a-F2-KDEL質體進行雙酶切(以BamH I及Sac I兩種限制酶進行酶切反應)，再將酶切後的PCR產物與pET24a-2a-F2-KDEL質體進行純化以及接合作用，以將PCR產物選殖到pET24a-2a-F2-KDEL質體，形成pET24a-PE-2a-F2-KDEL質體，並將pET24a-PE-2a-F2-KDEL質體利用轉殖作用(transformation)送入表現宿主大腸桿菌(E.coli)中，並進行定序確認增殖之PCR產物序列無誤。PE-2a-F2-KDEL抗原融合蛋白之DNA序列則如SEQ ID No：40所示，而其胺基酸序列則如SEQ ID No：41所示。
4. PE-2a-F2-KDEL抗原蛋白之表達
將上述含有pET24a-PE-2a-F2-KDEL質體之大腸桿菌(E.coli)以LB培養基培養，並以IPTG誘導PE-2a-F2-KDEL抗原融合蛋白(SEQ ID No：41)表達，蛋白表達及萃取方法如實施例一所述。實施例四不同亞群(subgroup)之PCV2 ORF2序列的分析
除了2a亞群(subgroup)之外，豬第二型環狀病毒(PCV2)還有其他亞群之病毒株，以下分別針對一2b亞群PCV2病毒株、2c亞群PCV2病毒株、2d亞群PCV2病毒株、及2e亞群PCV2病毒株之PCV2 ORF2序列，分析其ORF2之5’端第1至234個核苷酸以及第235至最後一個核苷酸之間片段的精胺酸(Arginine)含量。
首先，根據Wang等人(Wang et al.,Virus Research 2009,Genetic variation analysis of Chinese strains of porcine circovirus type 2)所提供之序列作為親源關係樹標準序列來分析SEQ ID No：15、SEQ ID No：19，結果顯示該SEQ ID No：15屬於PCV2 2b亞群(subgroup)的一員；該SEQ ID No：19屬於PCV2 2d亞群(subgroup)的一員(如圖一所示)；而SEQ ID No：50及SEQ ID No：52則分別為PCV2 2c亞群及PCV2 2e亞群之標準株。
PCV2 2b亞群株的序列分析結果如表三所示，該PCV2 2b亞群株的2b-ORF2核苷酸序列如SEQ ID No：15所示，胺基酸序列如SEQ ID No：16所示；其中，2b-ORF2之5’端第1至234個核苷酸片段編碼21個精胺酸，而2b-ORF2之5’端第235至699個核苷酸(不含終止密碼子)序列如SEQ ID No：17所示，其胺基酸序列如SEQ ID No：18所示，該片段編碼10個精胺酸；PCV2 2b亞群株的序列分析結果與PCV2 2a亞群株的序列分析結果一致，兩者ORF2蛋白N端序列之精胺酸含量皆為其他部份精胺酸含量的2倍以上(如表二及表三所示)。
PCV2 2c亞群株的序列分析結果如表四所示，該PCV2 2c亞群株的2c-ORF2核苷酸序列如SEQ ID No：50所示，胺基酸序列如SEQ ID No：51所示；其中，2c-ORF2之5’端第1至234個核苷酸片段編碼20個精胺酸，而2c-ORF2之5’端第235至702個核苷酸序列如SEQ ID No：54所示，其胺基酸序列如SEQ ID No：55所示，該片段編碼10個精胺酸；PCV2 2c亞群株的序列分析結果與PCV2 2a及2b亞群株的序列分析結果一致，三者ORF2蛋白N端序列之精胺酸含量皆為其他部份精胺酸含量的2倍以上(如表二、表三、表四所示)。
PCV2 2d亞群株的序列分析結果如表五所示，該PCV2 2d亞群株的2d-ORF2核苷酸序列如SEQ ID No：19所示，胺基酸序列如SEQ ID No：20所示；其中，2d-ORF2之5’端第1至234個核苷酸片段編碼21個精胺酸，而2d-ORF2之5’端第235至702個核苷酸片段(不含終止密碼子)序列如SEQ ID No：21所示，其胺基酸序列如SEQ ID No：22所示，該片段編碼10個精胺酸；PCV2 2d亞群株的序列分析結果與PCV2 2a、2b、及2c亞群株的序列分析結果一致，四者ORF2蛋白N端序列之精胺酸含量皆為其他部份精胺酸含量的2倍以上(如表二、表三、表四及表五所示)。
PCV2 2e亞群株的序列分析結果如表六所示，該PCV2 2e亞群株的2e-ORF2核苷酸序列如SEQ ID No：52所示，胺基酸序列如SEQ ID No：53所示；其中，2e-ORF2之5’端第1至234個核苷酸片段編碼20個精胺酸，而2e-ORF2之5’端第235至699個核苷酸片段(不含終止密碼子)序列如SEQ ID No：56所示，其胺基酸序列如SEQ ID No：57所示，該片段編碼9個精胺酸；PCV2 2e亞群株的序列分析結果與PCV2 2a、2b、2c及2d亞群株的序列分析結果一致，五者ORF2蛋白N端序列之精胺酸含量皆為其他部份精胺酸含量的2倍以上(如表二、表三、表四、表五及表六所示)。
與實施例一相同，本案亦分析了PCV2 2b亞群株、PCV2 2c亞群株、PCV2 2d亞群株及PCV2 2e亞群株之N端富含精胺酸區域(Arginine-rich domian)，及非富含精胺酸區域(non-Arginine-rich domain)之蛋白表現量，發現與實施例一結果相同，該N端富含精胺酸區域所編譯之蛋白片段難以被表達；然而，該非富含精胺酸區域所編譯之蛋白片段可易於生物表現系統中被表達；且進一步將該些精胺酸增加或刪除後，並分析蛋白質表現後，亦發現結果與PCV2 2a亞群株一致，當該些過多之精胺酸數量減少後，發現確實可增加PCV2 ORF2之蛋白表現量。
其中該富含精胺酸區域約在PCV2 ORF2全長胜肽之N端第1至78個胺基酸之間的區域；該非富含精胺酸區域約在PCV2 ORF2之N端第79個胺基酸至C端最後一個胺基酸之間的區域。實施例五 PCV2 2b次單位疫苗抗原蛋白片段之構築及表達
1. pET24a-2b-F2質體之構築及表達
本實施例針對實施例四之PCV2 2b亞群株的ORF2基因進行次單位疫苗抗原蛋白片段之構築。同實施例一及三，選用F2片段(PCV2 2b的ORF2基因5’端第235-468個核苷酸，以下稱為2b-F2片段)進行構築。該PCV2 2b亞群株的2b-F2片段之核苷酸序列如SEQ ID No：17所示，其胺基酸序列如SEQ ID No：18所示。以PCR擴增2b-F2片段核苷酸序列，PCR引子序列如下：正向引子pF-2b(含有Sac I限制酶酶切位置)：5’-CGAGCTCTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGC-3’(SEQ ID No：42)Sac I反向引子pR-2b(含有Hind III限制酶酶切位置)：5’-CCCAAGCTTGTAGGAGAAGGGCTGGGTTAT-3’(SEQ ID No：43)Hind III PCR反應條件為：95℃反應5分鐘後，進行95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒，共25個循環，最後以72℃反應5分鐘以進行延伸反應(elongation)；分別將PCR產物與pET24a表現載體(Novagen)進行雙酶切(以Sac I及Hind III兩種限制酶進行酶切反應)，再將酶切後的PCR產物與pET24a表現載體進行純化以及接合作用，以將PCR產物選殖到pET24a表現載體形成pET24a-2b-F2質體，並將該質體利用轉殖作用(transformation)送入寄主細胞大腸桿菌(E.coli)中，以進行大量增殖，並進行定序確認增殖之PCR產物序列無誤。接著將上述含有pET24a-2b-F2質體之大腸桿菌(E.coli)以LB培養基培養，並以IPTG誘導2b-F2抗原蛋白(SEQ ID No：18)表達，蛋白表達及萃取方法如實施例一所述。
2. pET24a-PE-2b-F2-KDEL質體之構築及表達
在本實施例中，除了以2b-F2胺基酸片段作為PCV2次單位疫苗之抗原片段之外，也在2b-F2胺基酸片段的N端及C端分別加上PE蛋白及KDEL蛋白質訊號序列，形成抗原融合蛋白PE-2b-F2-KDEL，以期誘導生物體產生更佳之免疫反應。
抗原融合蛋白PE-2b-F2-KDEL的DNA序列如SEQ ID No：44所示，而其胺基酸序列如SEQ ID No：45所示。表達該抗原融合蛋白PE-2b-F2-KDEL之質體(pET24a-PE-2b-F2-KDEL)的構築策略同實施例三。首先，取編碼KDEL蛋白質訊號序列之DNA序列(SEQ ID No：30)，轉殖到pET24a質體中，以形成pET24a-KDEL質體，pET24a-KDEL質體的構築方式如實施例三所述。然後，取上述PCR增殖之2b-F2片段DNA序列(SEQ ID No：17)，轉殖到該pET24a-KDEL質體中，以形成pET24a-2b-F2-KDEL質體。最後，取編碼PE蛋白之DNA序列(SEQ ID No：34)，轉殖到該pET24a-2b-F2-KDEL質體中，以形成pET24a-PE-2b-F2-KDEL質體，pET24a-PE-2b-F2-KDEL質體的構築方式亦如實施例三所述。接著將上述含有pET24a-PE-2b-F2-KDEL質體之大腸桿菌(E.coli)以LB培養基培養，並以IPTG誘導PE-2b-F2-KDEL抗原融合蛋白(SEQ ID No：45)表達，蛋白表達及萃取方法如實施例一所述。實施例六 PCV2 2d次單位疫苗抗原蛋白片段之構築及表達
1. pET24a-2d-F2質體之構築及表達
本實施例針對實施例四之PCV2 2d亞群株的ORF2基因進行次單位疫苗抗原蛋白片段之構築。同實施例一及三，選用F2片段(PCV2 2d的ORF2基因5’端第235-468個核苷酸，以下稱為2d-F2片段)進行構築。該PCV2 2d亞群株的2d-F2片段之核苷酸序列如SEQ ID No：21所示，其胺基酸序列如SEQ ID No：22所示。以PCR擴增2b-F2片段核苷酸序列，PCR引子序列如下：正向引子pF-2d(含有Sac I限制酶酶切位置)：5’-CGAGCTCTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGC-3’(SEQ ID No：46)Sac I反向引子pR-2d(含有Hind III限制酶酶切位置)：5’-CCCAAGCTTGTAGGAGAAGGGCTGGGTTAT-3’(SEQ ID No：47)Hind III PCR反應條件為：95℃反應5分鐘後，進行95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒，共25個循環，最後以72℃反應5分鐘以進行延伸反應(elongation)；分別將PCR產物與pET24a表現載體(Novagen)進行雙酶切(以Sac I及Hind III兩種限制酶進行酶切反應)，再將酶切後的PCR產物與pET24a表現載體進行純化以及接合作用，以將PCR產物選殖到pET24a表現載體形成pET24a-2d-F2質體，並將該質體利用轉殖作用(transformation)送入寄主細胞大腸桿菌(E.coli)中，以進行大量增殖，並進行定序確認增殖之PCR產物序列無誤。接著將上述含有pET24a-2d-F2質體之大腸桿菌(E.coli)以LB培養基培養，並以IPTG誘導2d-F2抗原融合蛋白(SEQ ID No：22)表達，蛋白表達及萃取方法如實施例一所述。
2. pET24a-PE-2d-F2-KDEL質體之構築及表達
在本實施例中，除了以2d-F2胺基酸片段作為PCV2次單位疫苗之抗原片段之外，也在2d-F2胺基酸片段的N端及C端分別加上PE蛋白及KDEL蛋白質訊號序列，形成抗原融合蛋白PE-2d-F2-KDEL，以期誘導生物體產生更佳之免疫反應。
抗原融合蛋白PE-2d-F2-KDEL的DNA序列如SEQ ID No：48所示，而其胺基酸序列如SEQ ID No：49所示。表達該抗原融合蛋白PE-2d-F2-KDEL之質體(pET24a-PE-2d-F2-KDEL)的構築策略同實施例三。首先，取編碼KDEL蛋白質訊號序列之DNA序列(SEQ ID No：30)，轉殖到pET24a質體中，以形成pET24a-KDEL質體，pET24a-KDEL質體的構築方式如實施例三所述。然後，取上述PCR增殖之2d-F2片段DNA序列(SEQ ID No：21)，轉殖到該pET24a-KDEL質體中，以形成pET24a-2d-F2-KDEL質體。最後，取編碼PE蛋白之DNA序列(SEQ ID No：34)，轉殖到該pET24a-2d-F2-KDEL質體中，以形成pET24a-PE-2d-F2-KDEL質體，pET24a-PE-2d-F2-KDEL質體的構築方式亦如實施例三所述。接著將上述含有pET24a-PE-2d-F2-KDEL質體之大腸桿菌(E.coli)以LB培養基培養，並以IPTG誘導PE-2d-F2-KDEL抗原融合蛋白(SEQ ID No：49)表達，蛋白表達及萃取方法如實施例一所述。實施例七 PCV2次單位疫苗抗原蛋白片段之免疫原性(immunogenicity)的分析-1
1.小鼠免疫試驗
將實施例一所得到之2a-F2重組蛋白(SEQ ID No：6)以及實施例三所得到之PE-2a-F2-KDEL重組蛋白(SEQ ID No：41)分別以弗氏完全佐劑製備為PCV2次單位疫苗，並進行小鼠(mice)免疫試驗，以比較這兩種重組蛋白引發試驗動物產生抗PCV2抗體之免疫原性。
取5~6週齡健康雌性清潔級Balb/c小鼠9隻作為試驗動物，所有小鼠的豬第二型環狀病毒(PCV2)ELISA抗體皆呈陰性。將這9隻小鼠隨機分為3組，每組3隻；第1、2組中，每隻小鼠分別以腹腔注射(intraperitoneally,I.P.)注射100 μg重組蛋白2a-F2及PE-2a-F2-KDEL。第3組則注射PBS作為負對照組。兩週後用相同免疫劑量加強免疫一次；各組隔離飼養觀察，首次免疫後第2、4、5、6週分別採血分離血清，以ELISA測定血清內抗PCV2之抗體力價。
2.血清抗體之判定-以ELISA測定抗PCV2抗體力價
以含有PCV2病毒抗原(300 ng/孔)之96孔抗原盤作為檢測套組。以含有500 μl/L Tween-20的50 mmol/L PBS(pH 7.2)(即PBST)洗滌抗原盤3次，每次3~5分鐘；再於抗原盤中加入0.15% BSA填充液(blocking solution)(200μL/孔)，以填充(block)抗原盤，並於37℃下作用2小時後，以PBS洗滌。將待檢測之小鼠血清以PBS緩衝液以1：50倍數稀釋，然後再做倍比稀釋；每個樣品8重複，每孔加100μL稀釋之小鼠血清，於37℃下作用1小時後，以PBS洗滌；然後加入鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)標定之anti-mouse IgG抗體，於37℃下作用1小時後，以PBS洗滌；接著加入磷酸對硝基苯酯(para-Nitrophenylphosphate,pNPP)溶液顯色，最後用1M的NaOH終止反應後判定結果。讀取各樣本在405 nm波長下之吸光值，每個樣本讀取兩次，並取平均值進行分析。
ELISA分析結果如圖六所示。相較於2a-F2重組蛋白片段(SEQ ID No：6)，PE-2a-F2-KDEL重組蛋白(SEQ ID No：41)可以引發試驗動物產生較高量之抗PCV2血清抗體，且於首次免疫第4週後，第1組及第2組小鼠產生之血清抗體量開始具有顯著差異(p<0.05)；到了首次免疫後第6週，兩組產生之血清抗體量差異更大(p<0.001)。另外，相較於注射PBS之負對照組，第1組及第2組小鼠之抗體產生量皆具有顯著差異(p<0.01)。實施例八 PCV2次單位疫苗抗原蛋白片段之免疫原性(immunogenicity)的分析-2
1.小鼠免疫試驗
在本實施例中，比較本發明PE-2a-F2-KDEL重組蛋白次單位疫苗以及PCV2全病毒疫苗引發試驗動物產生抗PCV2抗體之免疫原性。
將實施例三所得到之PE-2a-F2-KDEL重組蛋白(SEQ ID No：41)以油質佐劑Montanide ISA206(Seppic,France)製備為PCV2次單位疫苗。另外，取不活化之PCV2全病毒(10⁶TCID₅₀/ml)，以油質佐劑Montanide ISA206(Seppic,France)製備為PCV2全病毒疫苗，每一劑量之PCV2全病毒疫苗含有100 μl不活化之PCV2全病毒以及250 μl佐劑。接著進行小鼠免疫試驗。
取5~6週齡健康雌性清潔級Balb/c小鼠15隻作為試驗動物，所有小鼠的豬第二型環狀病毒(PCV2)ELISA抗體皆呈陰性。將這15隻小鼠隨機分為3組，每組5隻；第1組中的每隻小鼠分別以腹腔注射(I.P.)注射100 μg重組蛋白。第2組中的每隻小鼠分別以腹腔注射(I.P.)注射一劑量之PCV2全病毒疫苗。第3組則注射油質佐劑Montanide ISA206作為負對照組。三週後用相同免疫劑量加強免疫一次；各組隔離飼養觀察，首次免疫後第0、1、2、3、4、5週分別採血分離血清，以ELISA測定血清內抗PCV2之抗體力價。
2.血清抗體之判定-以ELISA測定抗PCV2抗體力價
同實施例七所述之”以ELISA測定抗PCV2抗體力價”之方法。ELISA分析結果如圖七所示。相較於PCV2全病毒疫苗，PE-2a-F2-KDEL重組蛋白(SEQ ID No：41)可以引發試驗動物產生較高量之抗PCV2血清抗體，且於首次免疫1週後，第1組及第2組小鼠產生之血清抗體量便具有顯著差異(p<0.001)；且相較於注射油質佐劑之負對照組，注射PE-2a-F2-KDEL重組蛋白之小鼠的抗體產生量，在首次免疫1週後便具有顯著差異(p<0.001)。
此外，將前述之2a-F2重組蛋白、PE-2a-F2-KDEL重組蛋白進行豬隻免疫，結果發現該等重組蛋白皆可誘發豬隻產生抗PCV2血清抗體。此外，亦藉由PCV2攻毒試驗評估該等重組蛋白之免疫保護效力：將該等重組蛋白配製成次單位疫苗後，進行豬隻免疫後，再以PCV2病毒株攻毒，結果發現經攻毒後，免疫組之保護率高於對照組(未施以疫苗者)；此處所指之保護率提高包含：病毒血症之降低、PCV2病徵之減緩。因此，證實該等重組蛋白所製備之PCV2次單位疫苗可有效提供動物產生免疫力，以提高動物之存活率。
相同地，本案進一步將PCV2 2b亞群株、PCV2 2c亞群株、PCV2 2d亞群株、及PCV2 2e亞群株之ORF2以實施例一至三之構築方式構築，進而以實施例七、八所述之免疫原性分析進行分析，結果發現，該等亞群株之ORF2片段(如：F2片段)及其融合蛋白(如：PE-F2-KDEL)所製備之PCV2次單位疫苗皆可誘發動物(如：豬隻)產生抗PCV2抗體，進而保護動物免於被PCV2病毒感染。
本發明所提供之PCV2次單位疫苗，與其他習用技術相互比較時，更具有下列之優點：
本發明所提供之PCV2次單位疫苗係利用基因重組技術，從PCV2病毒ORF2蛋白全長片段中選殖出於生物表現系統中可表現大量蛋白質之片段，利用該ORF2蛋白片段所製備之PCV2次單位疫苗，不但可以引發動物產生抗PCV2病毒之免疫力，且該ORF2蛋白片段可以基因重組技術大量生產，亦可降低製造疫苗之成本。
本發明所提供之另一PCV2次單位疫苗，係以PCV2病毒ORF2的F2蛋白片段與PE蛋白及KDEL蛋白質訊號序列形成PE-F2-KDEL抗原融合蛋白，經試驗結果顯示，此一次單位疫苗更可提高動物對抗PCV2病毒之免疫性及效率。
本發明所提供之PCV2次單位疫苗係利用基因重組技術所研發之次單位疫苗，其具備有生產製備簡單、成本低、純度高、產量高及安全性佳等優點。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。
綜上所述，本案所揭露之技術特徵已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。
圖一為豬第二型環狀病毒(PCV2)基因組序列之親緣樹分析圖。
圖二為PCV2 ORF2分段表現示意圖，其中pF1、pF2、pF3、pF4、pR1、pR2、pR3為PCR引子。
圖三為以SDS-PAGE分析以大腸桿菌分別表現PCV2 2a-ORF2各片段重組蛋白之結果；將大腸桿菌以IPTG誘導6小時後，收集全菌蛋白，以15% SDS-PAGE分析；其中第1道為標準分子量(molecular weight ladder)；第2道為pET24a載體(負對照組)；第3道為PCV2 ORF2 2a-F1片段(12.7 KDa)；第4道為PCV2 ORF2 2a-F2片段(11.6 KDa)；第5道為PCV2 ORF2 2a-F3片段(12.1 KDa)；第6道為PCV2 ORF2 2a-F4片段(16.5 KDa)；第7道為PCV2 ORF2 2a-F5片段(21.4 KDa)；第8道為PCV2 ORF2 2a-F6片段(20.8 KDa)；第9道為PCV2 2a-ORF2全長片段(27.5 KDa)。
圖四為以西方墨漬法檢測PCV2 2a-ORF2各片段重組蛋白表現之結果；其中第1道為標準分子量(molecular weight ladder)；第2道為pET24a載體(負對照組)；第3道為PCV2 ORF2 2a-F1片段(12.7 KDa)；第4道為PCV2 ORF2 2a-F2片段(11.6 KDa)；第5道為PCV2 ORF2 2a-F3片段(12.1 KDa)；第6道為PCV2 ORF2 2a-F4片段(16.5 KDa)；第7道為PCV2 ORF2 2a-F5片段(21.4 KDa)；第8道為PCV2 ORF2 2a-F6片段(20.8 KDa)；第9道為PCV2 2a-ORF2全長片段(27.5 KDa)。
圖五為大鼠分別以各不同長度片段之2a-ORF2重組蛋白免疫後，不同時間採集之血液樣本以PCV2 ELISA測定抗體力價之結果，*表示p<0.05。
圖六為小鼠分別以2a-F2重組蛋白以及PE-2a-F2-KDEL重組蛋白免疫後，不同時間採集之血液樣本以PCV2 ELISA測定抗體力價之結果，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001；#表示p<0.05，##表示p<0.01，###表示p<0.001。
圖七為小鼠分別以PE-2a-F2-KDEL重組蛋白以及PCV2全病毒疫苗免疫後，不同時間採集之血液樣本以PCV2 ELISA測定抗體力價之結果，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001；#表示p<0.05，##表示p<0.01，###表示p<0.001。
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<213> 綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)
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<223> 用以合成PCV2 ORF2片段的反向引子
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<400> 56
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<211> 155
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<213> 豬第二型環狀病毒(Porcine circovirus)
<400> 57

权利要求:
Claims (17)
[1] 一種抗豬第二型環狀病毒(Porcine circovirus type 2,PCV2)免疫組合物，包含一抗原胜肽，該抗原胜肽係選自由(a)及(b)所組成之群組中至少一者：(a)PCV2第二開放閱讀區(open reading frame 2,ORF2)非富含精胺酸胜肽(non-Arginine-rich peptide)，該PCV2 ORF2非富含精胺酸胜肽之精胺酸數量係為該PCV2 ORF2全長胜肽之N端富含精胺酸區域(Arginine-rich domian)之精胺酸數量的0至二分之一(1/2)倍；及(b)一重組融合蛋白，該重組融合蛋白自胺基端到羧基端包含：一PE胜肽，其具有如SEQ ID No：35之序列；一(a)項之PCV2 ORF2非富含精胺酸胜肽；以及一KDEL胜肽，其具有如SEQ ID No：31之序列。
[2] 如申請專利範圍第1項所述之免疫組合物，其中該PCV2 ORF2全長胜肽係具有一胺基酸序列，該胺基酸序列係選自由SEQ ID No：2、SEQ ID No：16、SEQ ID No：20、SEQ ID No：51、及SEQ ID No：53所組成之群組中至少一者。
[3] 如申請專利範圍第1項所述之免疫組合物，其中該PCV2 ORF2全長胜肽係具有一胺基酸序列，該胺基酸序列與選自SEQ ID No：2、SEQ ID No：16、SEQ ID No：20、SEQ ID No：51、及SEQ ID No：53的序列之一具有至少80%序列同源性(homology)。
[4] 如申請專利範圍第1項所述之免疫組合物，其中該富含精胺酸區域為該PCV2 ORF2全長胜肽之胺基端第1-78個胺基酸。
[5] 如申請專利範圍第1項所述之免疫組合物，進一步包含PCV2其他開放閱讀區(open reading frame,ORF)之抗原蛋白，該PCV2其他ORF之抗原蛋白包含ORF1及ORF3。
[6] 如申請專利範圍第1項所述之免疫組合物，進一步包含至少一種病原抗原，該病原抗原係選自由下列群組所組成者：豬流感病毒(SIV)抗原、豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)抗原、豬黴漿菌(Mycoplasma)、豬小病毒(Parvovirus,PPV)、豬丹毒(Erysipelas)，以及偽狂犬病(Aujeszky's disease)。
[7] 如申請專利範圍第1項所述之免疫組合物，其中該第(a)項所述之PCV2 ORF2非富含精胺酸胜肽，係選自由下列群組所組成者：SEQ ID No：6、SEQ ID No：8、SEQ ID No：10、SEQ ID No：12、SEQ ID No：18、SEQ ID No：22、SEQ ID No：55及SEQ ID No：57。
[8] 如申請專利範圍第1項所述之免疫組合物，可進一步包含一或多種選自於下者：載劑、溶劑、乳化劑、懸浮劑、分解劑、黏結劑、賦形劑、安定劑、螯合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤滑劑、界面活性劑、佐劑、生物型載體。
[9] 一種抗豬第二型環狀病毒(Porcine circovirus type 2,PCV2)免疫組合物，包含一抗原胜肽，該抗原胜肽係選自由(a)及(b)所組成群組中至少一者：(a)一PCV2 ORF2 F2胜肽，係為PCV2 ORF2全長胜肽之N端第79-156個胺基酸；以及(b)一重組融合蛋白，該重組融合蛋白自胺基端到羧基端包含：一PE胜肽，其具有如SEQ ID No：35之序列；一PCV2 ORF2 F2胜肽；以及一KDEL胜肽，其具有如SEQ ID No：31之序列。
[10] 如申請專利範圍第9項所述之免疫組合物，其中該PCV2 ORF2 F2胜肽係具有一胺基酸序列，該胺基酸序列係選自由SEQ ID No：6、SEQ ID No：18、SEQ ID No：22、SEQ ID No：55及SEQ ID No：57所組成之群組中至少一者。
[11] 如申請專利範圍第9項所述之免疫組合物，其中該PCV2 ORF2 F2胜肽係具有一胺基酸序列，該胺基酸序列與選自SEQ ID No：6、SEQ ID No：18、SEQ ID No：22、SEQ ID No：55及SEQ ID No：57的序列之一具有至少80%序列同源性(homology)。
[12] 如申請專利範圍第9項所述之免疫組合物，其中該第(b)項之重組融合蛋白係具有選自由SEQ ID No：41、SEQ ID No：45及SEQ ID No：49所組成之群組中至少一者。
[13] 一種製備豬第二型環狀病毒(PCV2)抗原片段的方法，包含：去除PCV2 ORF2 DNA序列中編碼N端富含精胺酸區域(Arginine-rich domain)的DNA序列，以得到一編碼一PCV2 ORF2非富含精胺酸區域(non-Arginine-rich domain)的DNA序列，該非富含精胺酸區域之精胺酸數量係為該富含精胺酸區域(Arginine-rich domian)之精胺酸數量的0至二分之一(1/2)倍；以及將該編碼一PCV2 ORF2非富含精胺酸區域(non-Arginine-rich domain)的DNA序列置於一生物表現系統中表現，得到抗豬第二型環狀病毒之免疫組合物的抗原片段。
[14] 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該PCV2 ORF2 DNA序列係為選自由SEQ ID No：1、SEQ ID No：15、SEQ ID No：19、SEQ ID No：50、及SEQ ID No：52所組成之群組中至少一者。
[15] 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該富含精胺酸區域為該PCV2 ORF2全長DNA序列之5’端第1-234個核苷酸之間的區域。
[16] 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該非富含精胺酸區域為該PCV2 ORF2全長DNA序列之5’端第235個核苷酸至3’端終止密碼子之間的區域。
[17] 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該編碼一PCV2 ORF2非富含精胺酸區域的DNA序列，係選自由下列群組所組成者：SEQ ID No：5、SEQ ID No：7、SEQ ID No：9、SEQ ID No：11、SEQ ID No：17、SEQ ID No：21、SEQ ID No：54及SEQ ID No：56。

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